Кількісне визначення білка на основі біуретової реакції – МАНЛаб


Кількісне визначення білка на основі біуретової реакції

Автор Шаповалов Євгеній
Науковий співробітник НЦ «Мала академія наук України». Сфера наукових інтересів: екологія, біотехнологія, аналітична хімія, загальна хімія, органічна хімія, біохімія, харчова експертиза, фізіологія харчування. Переможець Всеукраїнського конкурсу студентських наукових робіт за напрямом «Хімічні технології» (2014 р.), ІІ місце у конкурсі найкращих дипломних робіт за напрямом «Біотехнологія» (2014 р). Автор посібників по використанню цифрових вимірників на уроках хімії та біології

Завдання роботи:

  1. Ознайомитися з класифікацією та хімічними властивостями білків.
  2. Навчитися кількісно визначати вміст білків у розчинах.

Обладнання:

Апаратура:

  1. Фотоелектроколориметр.

Лабораторний посуд:

  1. Пробірки, 2 шт. (8 шт. у разі розробки калібрувального графіка).
  2. Піпетки, 10 мл., 3 шт.
  3. Піпетдозатор, 10 мл (можна замінити грушкою).
  4. Кювети для фотоколориметра.

Реактиви:

  1. Біуретовий реактив.
  2. 1, 2, 3, 4, 5%-ві розчини яєчного білка (для калібрувального графіка).

Теоретична частина

Білки

Біуретова реакція

Вміст білків у харчових продуктах

Принцип методу

У лужному середовищі за наявності солей купруму розчини білків набувають фіолетового забарвлення, яке зумовлене наявністю в молекулі білка пептидних зв’язків, що утворюють у зазначених умовах купрум-натрієві солеподібні комплекси. Інтенсивність забарвлення комплексу залежить від кількості пептидних зв’язків, а отже, від кількості білка в розчині та від кількості мідної солі. Якщо додавати визначену кількість солі купруму, то ступінь забарвлення буде прямо пропорційним концентрації білка в розчині.

Приготування реактивів

  • Біуретовий реактив

1,5 г купрум сульфату, 6 г сегнетової солі, 300 мл 10%-го розчину натрій гідроксиду перенесіть у мірну колбу на 1 л та доведіть до мітки водою.

  • 1, 2, 3, 4, 5%-ві розчини яєчного білка (для калібрувального графіка)

Розбийте яйце та відділіть білок від жовтка. У циліндр на 10 мл відберіть 1 мл яєчного білка. Кількісно перелийте в мірну колбу на 100 мл, промиваючи циліндр дистильованою водою. Доведіть до мітки дистильованою водою. Повторіть приготування з 2, 3, 4 та 5 мл яєчного білка.

Хід роботи

Побудова калібрувального графіка:

  1. Розмістіть 2 пробірки у штативі.
  2. У першу пробірку додайте 2 мл досліджуваного розчину, а у другу – 2 мл дистильованої води.
  3. Додайте в кожну пробірку 8 мл біуретового реактиву.
  4. Перемішайте та зачекайте 30 хв.
  5. Дослідіть усі розчини на світлопоглинання (світлопропускання), застосовуючи червоний світлофільтр (або за довжини хвилі 280 нм).
  6. Побудуйте градуювальний графік.

Відповідно до відомостей про яєчний білок, вміст білка у яєчному білку становить 11 г/100 г, а густина становить 1,045. Таким чином, наш градуювальний графік буде відповідати 1,1 г/л білка (1%), 2,2 г/л (2%), 3,3 г/л (3%), 4,4 г/л та 5,5 г/л.

Для більш точних досліджень необхідно провести детальний розрахунок.

Хід роботи

  1. Розмістіть 2 пробірки у штативі.
  2. У першу пробірку додайте 2 мл досліджуваного розчину, а у другу – 2 мл дистильованої води.

3. Додайте в кожну пробірку 8 мл біуретового реактиву.

4. Перемішайте та зачекайте 30 хв.

5. Перевірте оптичну густину при червоному світлофільтрі (або за довжини хвилі 280 нм).

5.1. У каретці для кювет розмістіть кювети з контрольним зразком та досліджуваною пробою.

5.2. За контрольним зразком виставте покази спектрофотометра на «0».

5.3. Перемістіть каретку на дослідження проби білків.

6. Проаналізуйте дані.

Аналіз даних

Визначте за градуювальним графіком вміст білків у розчині.

Розвиток дослідження

Дослідіть на вміст білків різні продукти: горох, пшеницю, ковбасу.