Визначення ізоелектричної точки білків

Автор Шаповалов Євгеній
Науковий співробітник НЦ «Мала академія наук України». Сфера наукових інтересів: екологія, біотехнологія, аналітична хімія, загальна хімія, органічна хімія, біохімія, харчова експертиза, фізіологія харчування. Переможець Всеукраїнського конкурсу студентських наукових робіт за напрямом «Хімічні технології» (2014 р.), ІІ місце у конкурсі найкращих дипломних робіт за напрямом «Біотехнологія» (2014 р). Автор посібників по використанню цифрових вимірників на уроках хімії та біології

Теоретична частина

Білки – складні високомолекулярні природні органічні речовини, що складаються з амінокислот, сполучених пептидними зв’язками.

Зазвичай білки є лінійними полімерами – поліпептидами, хоча інколи мають складнішу структуру. Невеликі білкові молекули, тобто олігомери поліпептидів, називаються пептидами.

Функції білків у клітині різноманітніші, ніж функції інших біополімерів – полісахаридів і нуклеїнових кислот. Так, білки-ферменти каталізують протікання біохімічних реакцій і грають важливу роль в обміні речовин. Деякі білки виконують структурну або механічну функцію, утворюючи цитоскелет, що є важливим засобом підтримки форми клітин. Також білки грають важливу роль у сигнальних системах клітин, клітинній адгезії, імунній відповіді і клітинному циклі.

Білки – важлива частина харчування тварин і людини, оскільки ці організми не можуть синтезувати повний набір амінокислот і повинні отримувати частину з них із білковою їжею. У процесі травлення протелітичні ферменти руйнують спожиті білки, розкладаючи їх до рівня амінокислот, які використовуються при біосинтезі білків організму або піддаються подальшому розпаду для отримання енергії.

Білки також характеризуються ізоелектричною точкою (pI) — кислотністю середовища pH, за якого молекула певного білка не несе електричного заряду (стає електронейтральною). Чим більше в цьому білку гідроксильних груп (основних залишків), тим вища в нього pI. Білки з pI, меншим за 7, називаються кислотними, а білки з pI, більшим за 7, – основними. Загалом pI білка залежить від функції, яку він виконує. Так, білки, що зв’язуються з нуклеїновими кислотами, часто належать до основних білків. Прикладом таких білків служать гістони.

За ступенем розчинності у воді білки бувають розчинними (гідрофільними) і нерозчинними (гідрофобними).

Окрім послідовності амінокислот поліпептиду, для функціонування білків украй важлива тривимірна структура, яка формується в процесі згортання білків (або фолдинга, від англ. folding). Ця структура утримується в результаті взаємодії структур нижчих рівнів. Тривимірна структура білків за нормальних природних умов називається нативним станом білка.

Рис 1. Основні рівні структурної організації білків

Первинна структура – пептидна або амінокислотна послідовність, тобто послідовність амінокислотних залишків у пептидному ланцюжку.

Вторинна структура – локальне впорядковування фрагменту поліпептидного ланцюжка, стабілізоване водневими зв’язками.

Рис 2. Приклади зображення тривимірної структури білків на прикладі триозофосфатізомерази

Ліворуч – «паличкова» модель, із зображенням усіх атомів і зв’язків між ними. Кольорами позначені різні атоми.

У середині – зображення елементів вторинної структури – α-спіралей і β-листів. Кольорами позначені типи елементів.

Праворуч – контактна поверхня білка. Кольорами позначені електростатичні властивості поверхні.

Третинна структура – повна просторова будова цілої білкової молекули, просторове взаємовідношення вторинних структур одна до одної. Третинна структура загалом стабілізується нелокальними взаємодіями, найчастіше формуванням гідрофобного ядра, а також завдяки утворенню водневих зв’язків, солевих містків, інших типів іонних взаємодій, дисульфідних зв’язків між залишками цистеїну.

Четвертинна структура – структура, що виникає в результаті взаємодії кількох білкових молекул, які в цьому контексті називають субодиницями. Повна структура кількох поєднаних субодиниць, що разом виконують спільну функцію, називається білковим комплексом.

Детальніше про ізоелектричну точку можна почитати за посиланням.

Принцип методу

Визначення ізоелектричної точки білків ґрунтується на здатності білків під дією осаджувачів, що викликають дегідратацію білків, при значенні рН середовища, що відповідає їх ізоелектричній точці, легко осаджуватися.

Приготування реактивів

1. 0,1 н. розчин оцтової кислоти

У мірну колбу на 250 мл додайте 10-20 мл дистильованої води. Зважте 1,5 г у хімічному стаканчику на вагах або за допомогою піпетки відберіть у стаканчик 1,5 мл льодяної оцтвої кислоти (концентрація близька до 100%, густина – 1,05 г/л) та кількісно перенесіть у мірну колбу на 250 мл. Доведіть до мітки розчин у мірній колбі дистильованою водою.

2. 0,01 н. розчин оцтової кислоти

У мірну колбу на 100 мл налийте 10 мл розчину 0,1 н. оцтової кислоти та доведіть до мітки дистильованою водою.

3. 0,5%-й розчин казеїну в 1 н. розчині натрій ацетату

У скляному стакані зважте 0,5 г казеїну. Кількісно перенесіть казеїн у мірну колбу. Доведіть до мітки 1 н розчином натрій ацетату. В разі, якщо казеїн не розчинився – розчин перенесіть у термостійку колбу та нагрійте.

Розчин натрій ацетату готують за такою методикою: в хімічному стакані зважте 8,4 г натрій ацетату; кількісно перенесіть його у мірну колбу на 100 мл; доведіть до мітки дистильованою водою.

Хід роботи

1. У штативі розташуйте 8 пробірок.
2. Позначте кожну з пробірок цифрами 1-8.
3. У кожну з пробірок налийте 1 мл розчину казеїну.

4. Додайте реактиви, зазначені в таблиці:

5. Зачекайте 30 хв.

6. Визначте пробірку з максимальним ступенем помутніння.

Аналіз даних

Визначте, в якій пробірці та, відповідно,  за якого рН розчин є наймутнішим. Це і є ізоелектрична точна зазначеного білка.

Розвиток дослідження

Дослідіть ізоелектричні точки різних білків.