Дослідження проходження мейозу в пилкових зернах представників роду Лілія

Завдання роботи:

дослідити проходження мейозу в рослин на прикладі представників роду Лілія.

Для цього потрібно виготовити тимчасові чавлені мікропрепарати з клітин-мікроспороцитів, які є попередниками сперміїв у Квіткових рослин; та дослідити й ідентифікувати за допомогою світлового мікроскопа (режим прохідного світла) різні стадії мейозу. Зазначену методику можна використовувати під час виконання учнівських науково-дослідницьких робіт з метою дослідження впливу біотичних, абіотичних та антропогенних факторів на проходження мейозу в рослин. Також цю модельну систему можна використовувати як індикатор на забруднення навколишнього середовища полютантами різної природи.

Обладнання:

• фіксатор Кларка (25 мл льодяної оцтової кислоти розчинити в 75 мл 96-відсоткового етилового спирту) – 100 мл;
• пеніцилінові пляшечки з кришечками – 5 шт.;
• пінцет з тонкими губками – 1 шт.;
• скальпель або канцелярський ніж – 1 шт.;
• ножиці канцелярські – 1 шт.;
• простий олівець – 1 шт.;
• заздалегідь приготована етикетка для підпису фіксації (відрізи офісного паперу розміром 2 см на 1 см) – 1 шт.;
• інсулінові шприци з голкою – 2 шт.;
• предметні скельця розміром 25,4×76,2 мм;
• покривні скельця розміром 24×24 мм;
• світловий мікроскоп з набором об’єктивів 10× та/або 20× та 40× та/або 63×;
• 2-відсотковий розчин барвника ацетоорсеїну або  10-відсотковий розчин ацетокарміну;
• 1-відсотковий водний розчин 45-відсоткової оцтової кислоти;
• одноразові пластикові піпетки – 5 шт. (окрема для кожної хімічної сполуки);
• спиртівка;
• фарфорова тонкостінна чашечка;
• «годинникове» скло 1 шт.;
• світловий мікроскоп з набором об’єктивів 10×, 40×, 63× та/або 100×;
• сірники;
• годинник.

Основні терміни та поняття

МЕЙОЗ Запліднення рослин ЖИТТЄВІ ФОРМИ РОСЛИН ЗАПИЛЕННЯ І ЗАПЛІДНЕННЯ У КВІТКОВИХ РОСЛИН Клітина рослин КВІТКА ЯК ОРГАН СТАТЕВОГО РОЗМНОЖЕННЯ РОСЛИН. БУДОВА І РІЗНОМАНІТНІСТЬ КВІТОК РІЗНОМАНІТНІСТЬ РОСЛИН КЛАСУ ОДНОДОЛЬНІ

Теоретична частина

Мейоз приводить до утворення статевих клітин не лише в людини й тварин, а й у рослин. Представники роду Лілія належать до клади Квіткові рослини або Покритонасінні,  відповідно, статеве розмноження у них відбувається за рахунок амфіміксису (запліднення або злиття двох статевих клітин). Основним статевим органом, який відповідає за запліднення, в Лілій є квітка – генеративний орган, який за походженням є видозміненим пагоном, що пристосований до утворення статевих клітин і здійснення статевого процесу і, як наслідок, утворення плодів та насіння. Відповідно, спостерігати за мейозом як фундаментальним клітинним процесом можна, досліджуючи архіспоріальну тканину (клітини-попередники мікроспороцитів) представників роду Лілії.

Утворення чоловічого гаметофіту починається з диференціювання тичинкового зачатку, утвореного квітковою меристемою. Спочатку в результаті поділу та диференціації меристеми квітки утворюються три клітинні шари. Клітини першого шару диференціюються й утворюють шар епідерми; другого шару – клітини архіспоріальної тканини, з яких потім будуть утворюватися мікроспороцити та клітини тапетуму (клітини-супутники, які здійснюють метаболізм у мікроспороцитів, що не здатні до обміну речовин через високу специфічність, часто є поліплоїдними та/чи двоядерними та утворюються в результаті ендомітозу або апоптозу); третього шару – діляться й утворюють провідну тканину пиляка. Мікроспороцити під час дослідження їх за допомогою світлового мікроскопа мають вигляд великих округлих клітин; вони часто утворюють клітини-попередники пилкових зерен – тетради, об’єднані по чотири за допомогою калози (полісахариду, який становить спільну оболонку для чотирьох клітин-тетрад).

Хід роботи

1. Попередньо потрібно знайти модель для дослідження. Для цього на околицях вашого міста чи села знайдіть представників роду Лілії, які ще не розквітли, проте вже викинули пуп’янки, довжиною приблизно 1 см. На теренах України представники роду Лілії починають квітувати в кінці травня й до кінця червня.
2. Налийте в пеніцилінову пляшечку 10 мл фіксатора, заздалегідь приготованого та охолодженого в холодильнику протягом 1 години.
3. Обережно зріжте пуп’янок потрібного розміру, помістіть його в пеніцилінову пляшечку з фіксатором та засічіть 1 годину. Протягом цього часу витримуйте пляшечку із зафіксованими пиляками за кімнатної температури.
4. На етикетці за допомогою простого олівця зазначте таку інформацію: назва фіксатора, вид роду Лілії та дата фіксації. Приклад показано нижче:
   

   Фіксатор Кларка (ацетоалкоголь 1:3) Пиляки Лілії тигрової 15.06.2024 р.

    

5. Після години обробки фіксатор злийте з пляшечки та утилізуйте, його не можна повторно використовувати!  
6. 40 мл етилового спирту 72-відсоткового водного розчину розлийте по 10 мл у 4 пеніцилінові пляшечки та пронумеруйте їх як 1, 2, 3 та 4.
7. За кімнатної температури з першої пляшечки зі спиртом налийте до пиляків 10 мл і витримайте 15 хв. Потім цей використаний спирт злийте назад до пляшечки № 1, залийте спирт з пляшечки № 2 та повторіть процедуру.
8. Спирт з пляшечки № 4 не зливайте: в ньому надалі будуть зберігатися зафіксовані пиляки.
9. Надалі зафіксовані та промиті в такий спосіб пиляки можна зберігати протягом 6 місяців у холодильнику та за потреби досліджувати.
10. Перед початком виготовлення чавлених мікропрепаратів за допомогою літературного пошуку з’ясуйте кількість диплоїдного набору хромосом в обраного вами для дослідження виду лілій. Наприклад, 2n Лілія лісова та Лілія тигрова = 24.
11. Витягніть з пеніцилінової пляшечки зафіксовані пиляки та помістіть їх до тонкостінної фарфорової чашечки.
12. Налийте до фарфорової чашечки 5 мл барвнику ацетоорсеїну або ацетокарміну та накрийте чашечку годинниковим склом.
13. Тримаючи фарфорову чашечку над запаленою спиртівкою, рівномірно нагрійте її до «прихованого» кипіння (тобто коли крапельки конденсату з’являться на годинниковому склі).
14. Нанесіть краплю розчину 45-відсоткової оцтової кислоти на предметне скельце та за допомогою пінцету перенесіть у цю краплю пофарбовані пиляки.
15. Тримаючи за один кінець пиляка голкою інсулінового шприца на предметному скельці, відріжте за допомогою скальпеля або леза вершечок протилежної частини пиляка.
16. Далі, тримаючи за один кінець пиляка голкою інсулінового шприца на предметному скельці, голкою іншого інсулінового шприца (частиною без отвору) обережно проведіть декілька разів по всій довжині пиляка. З пиляка має вийти архіспоріальна тканина.
17. За допомогою пінцету або голок інсулінового шприца видаліть стінки пиляка з предметного скельця та накрийте його покривним.
18. Накрийте покривне та предметні скельця відрізом фільтрувального паперу для видалення надлишків розчину оцтової кислоти.
19. Дослідіть отриманий препарат за допомогою об’єктивів світлового мікроскопа.

Аналіз даних

1. Порівняйте отримані вами результати з результатами ваших колег. Яка довжина пиляка в мм відповідає різним стадіям мейозу?
2. За якої довжини пиляків спостерігалося утворення тетрад і пилкових зерен?
3. Зробіть висновки до проведеної роботи, давши відповіді на такі запитання: чи траплялися на виготовленому вами чи вашими колегами препараті утворення патологічних діад? Якщо так, то з чим це пов’язано? Під час дослідження мікропрепарату намагайтеся ідентифікувати стадії мейотичного поділу мікроспороцитів. Відповідь запишіть до таблиці:

Результати проходження мейозу в представника роду Лілія_________________(впишіть назву досліджуваної рослини)

4. Перегляньте власноруч отримані результати, записані до таблиці, та з’ясуйте, яка стадія мейозу трапляється найчастіше.

5. Порівняйте отримані результати з результатами проходження мейозу в мікроспороцитах, отриманих з інших рослин Лілій вами чи вашими колегами.

6. Пригадайте, в яких природних умовах (рівень зволоженості, освітлення, тип ґрунту та ін.) розвивалися рослини Лілії, з яких ви виділяли пиляки. Як природні умови впливають на проходження мейозу в рослин? Відповідь обґрунтуйте.