Визначення Нітрогену амінних груп методом формольного титрування

Avatar
Автор Шаповалов Євгеній
Науковий співробітник НЦ «Мала академія наук України». Сфера наукових інтересів: екологія, біотехнологія, аналітична хімія, загальна хімія, органічна хімія, біохімія, харчова експертиза, фізіологія харчування. Переможець Всеукраїнського конкурсу студентських наукових робіт за напрямом «Хімічні технології» (2014 р.), ІІ місце у конкурсі найкращих дипломних робіт за напрямом «Біотехнологія» (2014 р). Автор посібників по використанню цифрових вимірників на уроках хімії та біології

Завдання роботи:

  1. Ознайомитися з класифікацією амінокислот.
  2. Ознайомитися з методикою визначення Нітрогену амінних груп методом формольного титрування.
  3. Навчитися проводити дослідження проби амінокислот на вміст Нітрогену амінних груп у лабораторних умовах.

Обладнання:

Лабораторний посуд:

  1. Колба конічна, 100 мл, 2 шт.
  2. Бюретка для титрування.
  3. Штатив лабораторний.
  • Можна замінити піпеткою з піпетдозатором

4. Піпетка, 2-10 мл, 2 шт.

5. Грушка або піпетдозатор.

Реактиви:

1. Гліцин або гідролізат білка, розчин, 0,25%.

  • Досліджувана проба

2. Фенолфталеїн, спиртовий розчин, 0,1%.

3. NaOH, натрій гідроксид, розчин, 0,1 н.

4. Формольна суміш.

Теоретична частина

Методи кількісного визначення амінокислот досить різноманітні і численні. У деяких випадках необхідно визначити сумарну кількість усіх амінокислот у гідролізаті білків або в екстрактах із біологічного матеріалу.

Один із таких методів, що базується на визначенні азоту амінних груп, був запропонований Сьоренсеном.

За зміною вмісту амінного Нітрогену можна судити про швидкість гідролізу білка, дії протеолітичних ферментів, швидкість перетворення білків та амінокислот у тканинах організму.

Під час гідролізу білка внаслідок розриву пептидних зв’язків у розчині відбувається збільшення вільних аміно- і карбоксильних груп. Амінокислоти у водних розчинах утворюють внутрішньомолекулярні солі, тому без попереднього блокування аміногруп безпосередньо титрувати лугом карбоксильні групи неможливо.

Принцип методу

Ґрунтується на здатності формальдегіду зв’язувати вільні аміногрупи з утворенням метиленових похідних амінокислот:


Аміногрупи при цьому втрачають основні властивості, а вільні карбоксильні групи відтитровують розчином лугу:

Існують кілька модифікацій методу формольного титрування, в основі яких лежать наведені реакції.

Приготування реактивів

  • 0,25%-й розчин гліцину або гідролізату білка.

Зважте 0,25 г гліцину (або гідролізату білка), кількісно перенесіть у мірну колбу на 100 мл та доведіть дистильованою водою до мітки.

  • 0,1%-спиртовий розчин фенолфталеїну.

Зважте 0,1 г фенолфталеїну та кількісно перенесіть у мірну колбу, додайте 10 мл спирту і доведіть до мітки дистильованою водою.

  • 0,1 н. розчин  натрій гідроксиду.

Наважку масою (4,0 ± 0,1) г натрій гідроксиду розчиніть дистильованою водою, яка не містить вуглекислого газу. В мірній колбі об’ємом 1 л розчин доведіть водою до мітки. Розчин можна приготувати зі стандарт-титру.

  • Формольна суміш.

У конічну колбу на 50 мл налийте 6 мл 20%-го  розчину формальдегіду. У присутності фенолфталеїну додавайте краплинами 0,1 н. розчин натрій гідроксиду до почервоніння рідини.

Увага: суміш використовувати лише свіжоприготовану.

Хід роботи

1.Налийте 3 мл 0,25% розчину амінокислот (або гідролізату білка) в конічну колбу на 25 мл.

2. Додайте спиртовий розчин фенолфталеїну.

3. Протитруйте натрій гідроксидом до почервоніння досліджуваної проби.

4. Відмірте за допомогою піпетки 2 мл формольної суміші та налийте в конічну колбу з пробою (спостерігається зникнення червоного забарвлення).

5. Протитруйте розчином натрій гідроксиду до появи червоного забарвлення.

6. Результат запишіть і проведіть обробку даних за формулою, наведеною нижче.

Аналіз даних

Кислотне число (КЧ) обчислюють за формулою:

Х=V*C*k,

де V – кількість розчину лугу, використаного на титрування, мл;

C – концентрація розчину натрій гідроксиду;

k – коефіціент відповідності 1 мл розчину 1 н.  натрій гідроксиду та масі Нітрогену, що дорівнює 14 (мг азоту)/(1 мл 1 н NaOH).

Для нашого випадку формула набуває вигляду:

Х=V*1,4 .

Розвиток дослідження

Порівняйте гідролізат горохового білка та білка тваринного походження. Спробуйте пояснити результат.