Визначення концентрації білка в молоці

Блок 1. Резюме

Робота присвячена вивченню кількості білка у молоці. Під час її виконання ви навчитеся робити розведення та обраховувати концентрацію утворених розчинів, працювати зі спектрофотометром (калориметром), будувати калібрувальні криві у програмі Exel, визначати абсолютну похибку досліджень.

Мета роботи: визначити концентрацію білка в молоці та порівняти отримані дані з даними, зазначеними виробником на етикетці.

Завдання роботи:

1. Зробити розведення, використовуючи відповідну таблицю.
2. У кожній пробірці провести біуретову реакцію.
3. Визначити оптичну густину кожного зразка.
4. Побудувати калібрувальну криву, до неї – лінію тренда, знайти рівняння прямої лінії тренда та коефіцієнт апроксимізації.
5. Провести біуретову реакцію з дослідним варіантом молока у трикратній повторюваності.
6. Підставити отримані оптичні густини у рівняння прямої лінії тренду та обрахувати концентрацію білка.
7. Порахувати абсолютну похибку власних досліджень.

Блок 2. Попередня інформація

Молоко є продуктом секреції молочних залоз самок ссавців. Молоко має унікальний склад, тому що це збалансована їжа для малят, виживання яких еволюційно залежало саме від хімічного складу молока. Узагальнено молоко містить білки, що є джерелом амінокислот для малюків, організм яких росте і потребує значної кількості амінокислот. Також до складу молока входять вуглеводи, зокрема дисахарид лактоза, який є джерелом енергії; вітаміни; готові антитіла (імунітет дитини спочатку повністю залежить від готових антитіл матері); макро- та мікроелементи.

У Європі під словом молоко найчастіше розуміють коров’яче молоко, хоча людина вживає у їжу й козяче та віслюкове молоко. Зараз набувають поширення вегетаріанські альтернативи молоку тваринного походження – вівсяне, кокосове молоко тощо.

Молоко було і залишається одним з основних продуктів харчування людини. Тому визначення кількості білка в ньому є цікавою експериментальною задачею, що має практичне застосування.

Найбільш універсальною якісною реакцією на наявність білка є біуретова реакція. Вважається, що вона є чутливою навіть за наявності кількох пептидних зв’язків.  Під час проходження цієї реакції свіжоосаджені йони Cu₂+ утворюють комплексні сполуки з амінокислотами в місцях руйнування пептидних зв’язків. Ці комплексні сполуки мають фіолетове забарвлення.

Основні хімічні процеси, які відбуваються під час біуретової реакції:

CuSO4+2NaOH=Cu(OH)2+Na2SO₄

Cu(OH)2-осад блакитного кольору

Продуктом біуретової реакції є хелатний комплекс фіолетового кольору.

Блок 3. Обладнання

Молоко (будь-якого виробника, але необхідно, щоб на ньому було вказано кількість білка), білок курячого яйця, пробірки, штативи, піпетки, піпетдозатори (самплери),  біуретовий реактив (1,5 г купрум сульфату, 6 г сегнетової солі, 300 см³ 10%-го розчину натрій гідроксиду перенести у мірну колбу на 1 дм³ та довести до мітки водою), вода, фільтрувальний папір, спектрофотометр та кювети до нього, будь-який гаджет з програмою Exel.

Фото 1. Необхідне обладнання

Основні терміни та поняття

БІЛОК І РІВНІ ЙОГО ОРГАНІЗАЦІЇ Біуретова реакція

Блок 4. Експериментальна процедура

1. У середньому кількість білка в яєчному білку становить 11г/100 мл, а ρ = 1,045 г/см³. Розведіть яєчний білок у 10 разів: для цього треба взяти 2 мл яєчного білка та 18 мл води. З отриманого розчину приготуйте розведення: 1:10, 2:10, 3:10, 4:10, 5:10. Розрахуйте теоретично концентрацію білка у кожному розведенні. Оскільки густина наближається до одиниці, то нею знехтуйте. З кожного розведення надберіть 2 мл білка, додайте 8 мл біуретового реактиву, зачекайте 20 хв (див. фото. 2). Виміряйте оптичну густину кожного зразка за довжини хвилі 540 нм.

Фото 2. Пробірки з різною концентрацією білка

2. Заповніть таблицю:

*Дані оптичної густини отримані за допомогою спектрофотометра ULAB 102 UV.

3. Побудуйте таку таблицю в табличному редакторі Exel:

4. У меню “Вставлення” необхідно обрати “Точкова діаграма” і побудувати графік. Клацнувши на графік, оберіть правою кнопкою функцію “Додати лінію тренду”, рівняння прямої до лінії тренду та величину вірогідності апроксимації. Коефіцієнт апроксимації демонструє точність і якість побудови калібрувальної кривої. За значення цього коефіцієнту менше 0,8 необхідно повторити розведення та вимірювання оптичної густини.

5. Для цього спектрофотометра й величин оптичної густити графік виглядає так (рис.1):

Рис. 1. Калібрувальний графік для визначення кількості білка

*У цьому випадку коефіцієнт апроксимації становить 0,9548.

6. До 2 мл молока додайте 8 мл біуретового реактиву, зачекайте 20 хв та виміряйте оптичну густину. У разі “зашкалу” (це такий стан приладу, коли він показує максимальну величину абсорбції; для приладу згаданої вище марки ця величина становить 3,000) можна розвести зразок після проходження біуретової реакції у 5 чи 10 разів.

Блок 5. Аналіз отриманих даних

Для цього зразка молока оптична густина складає 2,2. Розв’язуємо рівняння: 2,2 = 0,74х – 0,062, х = 3,06.

Тобто, відповідно до наших розрахунків, концентрація білка в дослідженому зразку молока становить 3,06 г/100 г продукту. На етикетці молока зазначено, що вміст білка – 2,9 г/100 г. Розрахуємо відносну похибку власних досліджень:

ε¡ = (3,06 – 2,9) / 2,9 = 0,06 або 6 %.

Блок 6. Напрями розвитку

Визначте вміст білка у вегетаріанських видах молока, наприклад у вівсяному та кокосовому; порівняйте його з кількістю білка в коров’ячому молоці.