Визначення активності каталази в рослинній сировині

Завдання роботи:

1. Ознайомитися з теоретичною частиною роботи.
2. Взяти зразки кореневої системи рослин  (не менше 1 г).
3. Приготувати білковий екстракт зазначених зразків.
4. Провести якісну реакцію, яка доводить наявність каталази.
5. Виміряти кількість білка в отриманих екстрактах.
6. Визначити активність каталази.
7. Використовуючи рівняння прямих калібрувальних графіків, обрахувати активність каталази.

Обладнання:

калориметри портативні з синім та червоним світлофільтром, нетбуки, фарфорові чашки та ступки, штативи, пробірки, лійки, фільтрувальний папір, ваги, піпетки з поділками, фізіологічний розчин (0,9 % NaCl), 10 % NaOH, насичений розчин CuSO₄, 3% H₂O_2, 4% молібдат амонію, 1% розчин гідрохінона (свіжовиготовлений), калібрувальний розчин білку горохового борошна, пінцети, ланцети, ножиці, пісок річковий очищений.

Основні терміни та поняття

ФЕРМЕНТИ І БІОЛОГІЧНИЙ КАТАЛІЗ Ферменти

Теоретична частина

Каталаза (КФ 1.11.1.6) — фермент класу оксидоредуктаз, виявлений майже в усіх еукаріотичних організмів; у рослинних клітинах локалізована в пероксисомах і цитозолі. За нормальних фізіологічних умов вона регулює вміст пероксиду водню в організмі, запобігає його токсичній дії, відіграє важливу роль у процесі старіння рослин.

Каталаза розкладає пероксид водню до води і кисню. У клітинах тварин пероксид водню утворюється під час процесів окиснення сполук і одразу знешкоджується каталазами, оскільки пероксид водню є досить агресивною сполукою, яка викликає руйнування мембран, органел, має мутагенний ефект.

У рослинній клітинні виступає агентом, який сигналізує про несприятливі умови. Відомо, що надходження важких металів, наявність засолення, дія високих/низьких температур, радіаційного випромінювання в рослини призводить до оксидативного стресу й утворення активних форм кисню, наприклад перекису водню. Оксидативний стрес є одним із типів пошкоджень, спричинених важкими металами. Під час цього стресу, зокрема, утворюється супероксид аніону, який надалі веде до продукування гідроксильних радикалів та перекису водню. Пероксид водню є сигналом для активації захисних систем, активатором експресії генів і процесів, що призводять до стійкості рослин. Одним із ферментів таких захисних систем є каталаза. Тому визначення активності каталази є маркером перебування рослини в стресових умовах.

Якісне визначення активності каталази базується на окисненні гідрохінона. Коли до білкового екстракту, отриманого з рослинної сировини, додають пероксид водню, то каталази, які там містяться, розкладають пероксид до води і кисню, а кисень окислює гідрохінон до хінона, при цьому виникає коричневе забарвлення (рис. 1).

Кількісне визначення, запропоноване в цьому дослідженні, базується на тому, що пероксид водню, взаємодіючи з  молібдатом амонію, утворює сполуку жовтого кольору, інтенсивність забарвлення якої вимірюється калориметром.

Для визначення активності ферменту використовують формулу (1):

Кількість білка вимірюється за допомогою біуретової реакції.

Хід роботи

І. Побудова калібрувального графіку для визначення кількості білка.

1. Візьміть горох сухий колотий, подрібніть його за допомогою кавомолки, щоб отримати горохове борошно.
2. За допомогою терезів відміряйте 0,5 г горохового борошна.
3. До 0,5 г горохового борошна додайте 100 мл та ретельно перемішуйте протягом 2 годин вручну або за допомогою шейкера. Можливий інший варіант – залити горохове борошно фізіологічним розчином та залишити на ніч, після чого відфільтрувати за допомогою складчатого фільтру. У такий спосіб отримаєте вихідний розчин білка; концентрація білка в ньому 1000 мкг/мл.
4. Підготуйте ряд пробірок для вимірювання коефіцієнту пропускання відповідно до таблиці 1.
   

   Концентрація білка (мкгБ/мл)	Об’єм вихідного розчину (мл)	Об’єм води (мл)	NaOH 10%  (мл)	CuSO4 (краплі)	Коефіцієнт пропускання	Оптична густина
   1000	3	–	3 мл	3
   750	2,25	0,75	3 мл	3
   500	1,5	1,5	3 мл	3
   250	0,75	2,25	3 мл	3
   100	0,3	2,7	3 мл	3

   50

   0,15

   2,85

   3 мл

   3

   Відповідно до біуретової реакції, розчин білка, взаємодіючи з йонами Купруму, утворює комплексні сполуки фіолетового кольору (рис. 1).

Рис. 1. Пробірки для побудови калібрувальної кривої для визначення кількості білка

5. Визначте коефіцієнт пропускання за допомогою портативного калориметра, використовуючи червоний світлофільтр (рис 2).

Рис. 2. Загальний вигляд калориметра, який з’єднаний з цифровою лабораторією einsteinLabMate та керується програмним забезпеченням MiLab

6. Отриману величину коефіцієнту пропускання переведіть у оптичну густину за формулою: D=-lgK, де К – у частках від одиниці (2).

7. За допомогою програми Excel побудуйте калібрувальну криву, на осі ОХ відкладіть концентрацію білка, а на осі ОУ – оптичну густину; до калібрувальної кривої проведіть лінію тренда і встановіть рівняння реакції (для прикладу наводимо рис. 3). Звертаємо увагу, що для кожного приладу необхідно будувати власну калібрувальну криву.

Рис. 3. Приклад калібрувального графіку для визначення кількості білка

8. Для побудови калібрувальної кривої для визначення кількості пероксиду водню необхідно провести такі розведення (таблиця 2):

9. Визначте коефіцієнт пропускання  за допомогою портативного калориметра, використовуючи синій світлофільтр.

10. Отриману величину коефіцієнту пропускання переведіть у оптичну густину за формулою: D=-lgK, де К – у частках від одиниці.

11. За допомогою програми Excel побудуйте калібрувальну криву, на осі ОХ відкладіть концентрацію пероксиду водню, а на осі ОУ – оптичну густину, до калібрувальної кривої проведіть лінію тренда і встановіть рівняння реакції (для прикладу наводимо рис. 4) Звертаємо увагу, що для кожного приладу необхідно будувати власну калібрувальну криву.

Рис. 4. Приклад калібрувального графіку для визначення кількості пероксиду водню

11. Відріжте зразки коренів масою 1 г, подрібніть зразки за допомогою ножиць.

12. У ступці перетріть зразки спочатку з додаванням піску, потім додайте 10 мл фізіологічного розчину, ретельно перемішайте, відфільтруйте (рис. 5, рис. 6).

Рис. 5. Перетирання рослинної сировини у фарфорових ступках

Рис. 6. Процес фільтрування

13. Відберіть 1,5 мл фільтрату, додайте 1,5 мл 10% натрій гідроксиду і 2 краплі купрум сульфату. Перемішайте та виміряйте коефіцієнт пропускання за допомогою калориметра, використовуючи червоний світлофільтр. Отриману величину переведіть у оптичну густину за формулою: D=-lgK, де К – у частках від одиниці.

Отримане значення оптичної густини підставте в рівняння калібрувальної кривої. Обчисліть вміст білка в отриманих фільтратах.

14. Відберіть 1,5 мл фільтрату та додайте 1,5 мл 1% гідрохінона, спостерігайте за появою коричневого забарвлення, що свідчить про наявність ферменту каталази (рис. 7).

Рис. 7. Якісна реакція на фермент каталазу з гідрохіноном: К1 – 1% розчин гідрохінона, К2 – фільтрат із рослини, Д2 – під дією кисню гідрохінон перетворюється на хінон і розчин стає коричневим.

15. Для визначення вмісту пероксиду водню в нульовій пробі у початковий момент часу до 1,5 мл фільтрату додайте 1,5 мл молібдату амонію та виміряйте коефіцієнт пропускання на калориметрі, використовуючи синій світлофільтр. Переведіть отриману величину в оптичну густину за формулою (2). Отримане значення оптичної густини підставте в рівняння калібрувальної кривої. Обчисліть НР₀.

16. Для визначення вмісту пероксиду водню в дослідній пробі після закінчення інкубації відберіть 1,5 мл фільтрату, додайте 1,5 мл пероксиду водню та 1,5 мл молібдату амонію. Через 1 хв виміряйте коефіцієнт пропускання на калориметрі, використовуючи синій світлофільтр. Переведіть отриману величину в оптичну густину за формулою (2). Отримане значення оптичної густини підставте в рівняння калібрувальної кривої. Обчисліть НР1.

17. Використовуючи формулу (1), порахуйте активність ферменту каталази.

Аналіз даних

Порівняйте активність цього ферменту в рослин одного виду, які ростуть у різних умовах, і в рослин різних видів.