Визначення амінокислот методом тонкошарової хроматографії
Завдання роботи:
- Ознайомитися з теоретичними відомостями про амінокислоти.
- Ознайомитися з функціями амінокислот для організму людини.
- Отримати поняття про незамінні амінокислоти та повноцінні білки.
- Ознайомитися з методикою визначення амінокислот у розчині.
- Навчитися проводити дослідження водного розчину на вміст амінокислот у лабораторних умовах.
Обладнання:
Апаратура:
- Сушильна шафа.
- Фотоелектроколориметр.
- Лабораторна центрифуга.
- Годинник.
Лабораторний посуд:
- Хімічний стакан об’ємом 500 мл.
- Хроматографічна пластинка.
- Мікропіпетки.
Реактиви:
- C9H6O4, нінгідрин, розчин в ацетоні оцтовокислому, 0,5%.
- CuSO4, купрум сульфат, спиртовий розчин, 0,005%.
- NiSO4, нікель сульфат, водний розчин, 1,0%.
- Стандартні розчини амінокислот.
- Розчинник для хроматографії (н-бутанол та крижана оцтова кислота).
Теоретична частина
Амінокислота — органічна сполука, молекули якої одночасно містять аміно- (-NH2) та карбоксильну (-СООН) групи. Амінокислоти є мономерними одиницями білків, у складі яких залишки амінокислот з’єднані пептидними зв’язками. Більшість білків побудовані з комбінації дев’ятнадцяти «первинних» амінокислот, тобто таких, що містять первинну аміногрупу, і однієї «вторинної» амінокислоти або імінокислоти (містить вторинну аміногрупу) проліну, що кодуються генетичним кодом. Їх називають стандартними або протеїногенними амінокислотами. Крім стандартних, у живих організмах зустрічаються й інші амінокислоти, які можуть входити до складу білків або виконувати інші функції.
Залежно від того, до якого атома вуглецю приєднана аміногрупа, амінокислоти поділяються на α-, β-, γ- тощо. α-атомом вважається той атом карбону, до якого приєднана карбоксильна група; якщо ж біля нього розташована й аміногрупа, така амінокислота називається α-амінокислотою. Якщо аміногрупа приєднана до наступного (β) атома карбону, це буде β-амінокислота, і так далі. Усі протеїногенні амінокислоти є α-амінокислотами.
Принцип методу
Ґрунтується на розділенні суміші амінокислот між двома фазами – рухомою та нерухомою.
Приготування реактивів
- 0,5%-й розчин нінгідрину в ацетоні оцтовокислому.
Зважте 0,5 г нінгідрину, кількісно перенесіть у мірну колбу на 100 мл, додайте 10 мл ацетону. Додайте 4 мл дистильованої води та 1 мл льодяної оцтової кислоти, перемішайте, доведіть до мітки ацетоном.
- CuSO4, купрум сульфат, спиртовий розчин, 0,005%.
Зважте 0,005 г CuSO4×3H2O на аналітичних вагах у хімічному стакані (бюксі). Додайте 21 мл дистильованої води. Кількісно перенесіть розчин у мірну колбу на 100 мл. Доведіть до мітки 96%-м етанолом;
- 1,0%-й водний розчин нікель сульфату.
Зважте 1 г NiSO4, перенесіть у мірну колбу на 100 мл та доведіть до мітки дистильованою водою.
- Станадартні розчини амінокислот (свідків).
Зважте та кількісно перенесіть у мірну колбу на 100 мл 0,1 г амінокислоти (або суміші амінокислот) та доведіть до мітки 0,1 н. розчином хлоридної кислоти або 10%-м етанолом.
- Приготування 0,1 н. розчину хлоридної кислоти.
У мірну колбу на 1 л додайте 100 мл дистиляту, зважте на вагах 3,646 г HCl та кількісно перенесіть у мірну колбу. Доведіть об’єм до мітки дистильованою водою.
- Розчинник для хроматографії.
Готувати під витяжкою! У хімічний стакан на 50 мл додайте 33 мл н-бутанолу, 8 мл крижаної оцтової кислоти та 8 мл дистильованої води. Перемішайте за допомогою скляної палички.
Увага: використовувати лише свіжоприготований!
Хід роботи
І. Якісне визначення
1. На хроматографічній пластинці позначте олівцем лінію на відстані 1 см від краю пластинки.
2. Мікропіпеткою нанесіть на лінію по 3 мкл проб та свідків (так, щоб діаметр нанесеної плями становив не більше ніж 3 мм) на відстані 1 см один від одного.
3. У хімічний стакан на 1 л налийте 35 мл розчинника (з розрахунку на утворення шару рідини висотою не більше 0,5 см – хроматографічна камера).
4. Розмістіть хроматографічну пластинку в хроматографічній камері вертикально, застосовуючи підпірки.
5. Накрийте камеру часовим склом або чашкою Петрі. Зачекайте 30 хв.
6. Нагрійте в сушильній шафі протягом години за температури 80 °С .
7. Вийміть хроматографічну пластинку і перемістіть її до витяжної шафи.
8. Під витяжною шафою обприскайте пластинку розчином нінгідрину, використовуючи пульверизатор (або занурте пластинку в нього).
9. Перенесіть пластинку у сушильну шафу та висушіть пробу за температури 90 °С протягом 6 хв.
10. Порівняйте положення досліджуваного розчину і свідків на хроматографічній пластинці (принцип методу, аналіз даних).
Аналіз даних
Визначте вид амінокислоти, порівнюючи дистанцію, на яку піднялися досліджуваний розчин та розчини свідків (може бути декілька точок).